بررسى اثرات ضدمیکروبى عصاره اتانولى پوسته و مغز هسته میوه پسته وحشى (Pistacia khinjuk Stocks)

Transcript

1 DOI: فصلنامه علوم و فناوری های نوين غذايی سال اول شماره ٤ صفحه ٨٨-٨١ تابستان ١٣٩٣ بررسى اثرات ضدمیکروبى عصاره اتانولى پوسته و مغز هسته میوه پسته وحشى (Pistacia khinjuk Stocks) 6 سید حمید مرتضوى 1* صدیف آزادمرد دمیرچى 2 محمود صوتى 3 رزاق محمودى 4 فیروزه صفاي یان 5 سجاد مرادى 1. دانش آموخته کارشناسی ارشد گروه علوم و صنایع غذایى دانشکده کشاورزى دانشگاه تبریز 2.دانشیار گروه علوم و صنایع غذایى دانشکده کشاورزى دانشگاه تبریز 3.استادیار گروه علوم و صنایع غذایى دانشکده کشاورزى دانشگاه تبریز 4. استادیار گروه بهداشت مواد غذایى و آبزیان دانشکده دامپزشکى دانشگاه تبریز 5. کارشناس گروه باکترى شناسى دانشکده پزشکى دانشگاه علوم پزشکى تبریز 6. دانش آموخته کارشناسی ارشد گروه علوم و صنایع غذایى دانشکده کشاورزى دانشگاه تبریز (تاریخ دریافت: 92/11/20 تاریخ پذیرش: 93/3/31) چکیده در این پژوهش اثرات ضدمیکروبى عصاره اتانولى پوسته و مغز هسته میوه پستهوحشى گونه خینجوك علیه باکترى مورد بررسى قرار گرفت. به این منظور عصاره اتانولى میوه پستهوحشى به و روش غوطه-ورى بهدست آمد. با استفاده از روش رقیقسازى آگار و رقیقسازى در لوله حداقل غلظت مهارکنندگی رشد (MIC) و حداقل غلظت کشندگی عصارهها (MBC) تعیین گردید. همچنین قطر هاله عدم رشد از آزمون انتشار در آگار با استفاده از دیسک تعیین شد. کدورت سوسپانسیون میکروبی تهیه شده با استفاده از محلول 0/5 استاندارد مک فارلند برابر با حدود 10 1/5 8 CFU/ml تنظیم گردید. از محیط کشتهاى نوترینت آگار و نوترینت براث براى آزمایشهاى رقتسازى در لوله استفاده شد. نتایج نشان داد که عصاره اتانولى پستهوحشى اثرات ضدمیکروبى علیه هر دو باکترى گرم مثبت و گرم منفى دارد. میزان MIC و MBC براى هر دو باکترى در عصاره پوسته کمتر از عصاره مغز هسته بود. همچنین در روش رقیقسازى در آگار عصاره پوسته تاثیرات ضدمیکروبى بهترى نسبت به مغز هسته ار خود نشان داد. قطر هاله عدم رشد براى باکترى اشرشیاکلاى بیشتر از استافیلوکوکوس اوري وس بود. همچنین قطر هاله عدم رشد عصاره پوسته بیشتر از عصاره مغز هسته براى هر دو باکترى بهدست آمد. بیشترین تاثیر در جلوگیرى از رشد باکترىها مربوط به عصاره پوسته علیه باکترى اشریشیاکلاى است. اثرات ضدمیکروبى عصاره اتانولى میوه پستهوحشى علیه باکترى گرم منفى بیشتر از باکترى گرم مثبت مشاهده شد که مىتواند بهدلیل مقاومت لایه پپتیدوگلیکان دیواره سلولى باکترىهاى گرم مثبت باشد. واژههاى کلیدي: khinjuk پستهوحشى ضدمیکروبى حداقل غلظت بازدارندگى انتشار دیسک. * مسي ول مکاتبات: Hamidmort1@yahoo.com

2 82 فصلنامه علوم و فناوری های نوين غذايی سال اول شماره ٤ تابستان ١٣٩٣ 1- مقدمه استفاده از آنتى بیوتیک ها در اکثر کشورها براى درمان بیمارى ها و جلوگیرى از عفونت ها بسیار معمول مى باشد و عواقب بعد از آن به خاطر سنتزى و شیمیایى بودن آن و مقاومت بدن نسبت به آنتى بیوتیک مى تواند سلامت مردم جامعه را مورد تهدید قرار دهد از این رو امروزه استفاده از ترکیبات گیاهى براى درمان بیمارى-ها و عفونت ها به خصوص در کشورهاى در حال توسعه مورد توجه قرار گرفته است. هم چنین علاوه بر ویژگى هاى ضدمیکروبى گیاهان و ترکیبات طبیعى موجود در آن بعضى از این گیاهان داراى خواص تغذیه اى و آنتى اکسیدانى مى باشند که باید در رژیم غذایى افراد جامعه مورد توجه قرار بگیرد. اکثر گیاهان وحشى (کوهى) داراى چنین ویژگى هایى بوده و ایران به عنوان یکى از مناطق اصلى رویشگاه هاى این گیاهان به خصوص در دامنه هاى رشته کوه زاگرس محسوب مى شود.[1] پسته وحشى گونه خینجوك در مکا ن هایى با عرض جغرافیایى متر بالاى سطح دریا پراکنده شده است. این گیاه در زبان فارسى به نام خنجوك 1 یا کلخنگ 2 شناخته شده است. علاوه بر این میوه این گیاه به عنوان یک میوه خوراکى کوهى (وحشى) مورد استفاده است. قاسمى پیربلوطى و همکاران (2011) در آنالیز اسانس میوه پسته وحشى گونه خینجوك گزارش دادند که ترکیباتى از جمله phellandrene α-pinene terpinolene و... در ترکیب این میوه وجود دارد که این ترکیبات تاثیرات ضدمیکروبى علیه گونه هاى مختلف باکترى ها دارند [2]. دو ترکیب α-pinene و terpinolene جزء ترکیبات اصلى با ویژگى هاى ضدمیکروبى بالا هستند [ 3 و 4 ]. در این پژوهش سعى بر آن است تا با گزارش اطلاعات کاملى از ویژگى هاى ضدمیکروبى پوسته و هسته میوه پسته وحشى گونه خینجوك این گونه مورد توجه محققین براى پژوهش هاى توسعه اى و کاربردى بعدى قرار گیرد. 2- مواد و روش ها 1-2- شناسایى گونه گیاهى پسته وحشى براى شناسایى گونه گیاهى پسته مورد مطالعه در این پژوهش میوه و برگ درخت پسته در شهرستان باشت استان کهگیلویه و بویراحمد جمعآورى شد. میوه درخت در سایه خشک گردید و برگ درخت در بین دو ورقه کاغذى قرار گرفت و هر روز با انجام عمل هوادهى در بین دو ورقه خشک شد. سپس نمونهها به هرباریوم دانشکده داروسازى دانشگاه علوم پزشکى تبریز (Tbz-Fph) منتقل شد. گونه مورد مطالعه با نام علمى Pistacia khinjuk Stocks شناسایى و با شماره 733 در هرباریوم نگهدارى مىشود آماده سازى نمونهها در این پروژه آزمونها به صورت جداگانه بر روى پوسته و مغز هسته میوه پستهوحشى انجام شد. در ابتدا پوسته میوه از هسته جدا شد سپس هستهها را خرد کرده و مغز داخل آن جداسازى گردید. پوسته و مغز هسته در دماى 18 C- تا زمان انجام آزمونها نگهدارى شد آماده سازى پودر چربى گرفته پوسته و هسته پستهوحشى جهت استخراج عصاره اتانولى از پوسته و مغز هسته پستهوحشى به دلیل اینکه داراى مقادیر بالایى از روغن مىباشد ابتدا باید با هگزان به روش سرد روغن از نمونه استخراج شود سپس عصاره گیرى انجام شود. بدین منظور نمونهها با هگزان با نسبت 1:5 (وزنى-حجمى) مخلوط شده و به مدت 2 ساعت روى همزن با دور 400 rpm در دماى اتاق قرار گرفتند. در ادامه مخلوط حاصل با کاغذ صافى واتمن شماره 1 با استفاده از پمپ خلا صاف شده و نمونههاى روى کاغذ صافى در آون 40 C خشک شدند [5] عصارهگیرى از پودر چربى گرفته پستهوحشى جهت عصارهگیرى از حلال اتانول 80 استفاده شد. پودرهاى پوسته و مغز هسته در حلال اتانول (نسبت پودر و حلال 6:1 وزنى حجمى) مخلوط گردید و در شیکر با دور 400 rpm به مدت 2 ساعت در دماى اتاق قرار گرفت پس از آن توسط کاغذ صافى واتمن شماره 1 صاف گردید مواد باقیمانده در کاغذ صافى با مقدارى اتانول شستشو دادهشد تا عصارهگیرى 1. Khenjuk 2. Kelkhong

3 83 سيد حميد مرتضوی و همکاران بررسی اثرات ضدميکروبی عصاره اتانولی پوسته و مغز هسته ميوه پسته وحشی به طور کامل انجام شود. سپس مخلوط فیلتر شده جهت تبخیر حلال در پلیت شیشه اى ریخته شد و در آون 40 C تا زمان خشک شدن کامل عصاره قرار گرفت. پودر عصاره هاى به دست آمده از نمونه با کاردك از پلیت جدا شد و پودرها تا زمان انجام آزمایش در دماى 18- C قرار گرفتند [6] آزمون هاى میکروبى جهت ارزیابى ویژگى هاى ضد میکروبى عصاره اتانولى پوسته و مغز هسته پسته وحشى ١ MIC و 2 MBC عصاره ها با روش 4 رقیق سازى در لوله 3 [ 9 و 10 ] و هم چنین روش رقت سازى آگار [13] تعیین شد. براى تعیین خواص ضدمیکروبى از دو باکترى شاخص استافیلوکوکوس اوري وس به عنوان گرم مثبت و دیگرى اشریشیاکلاى به عنوان گرم منفى استفاده شد. هم چنین میزان هاله ى عدم رشد باکترى ها با روش انتشار در آگار با استفاده از دیسک 5 [ 11 و 12 ] مورد ارزیابى قرار گرفت باکترى هاى مورد مطالعه باکترى هاى مورد مطالعه اشریشیاکلاى O157:H7 با شماره ATCC10536 و استافیلوکوکوس اوري وس با شماره ATCC25923 بود که به صورت لیوفیلیزه از سازمان پژوهش هاى علمى صنعتى ایران تهیه گردید تهیه سوسپانسیون باکتریایى آمپول هاي لیوفیلیزه باکتري ) 6 و ( ابتدا در شرایط سترون باز و به محیط کشت مایع (Nutrient broth) NB انتقال و به مدت 24 ساعت در 37 C انکوبه شد. سپس جهت اطمینان از خالص بودن باکتري از محیط نوترینت براث یک شبه به صورت خطی بر روي محیط کشت انتخابی- افتراقی کشت داده شد و به مدت 48 ساعت در 37 C انکوبه گردید. سپس از کلنی باکتري یک لوپ برداشت کرده و 24 ساعت قبل از هر آزمون آن را به نوترینت براث تلقیح نموده و به همین صورت براي هر آزمون جهت بررسی اثرات ضدمیکروبی کشت تازه 24 ساعته تهیه گردید. با استفاده از سمپلر یک میلىلیتر از سوسپانسیون میکروبى 24 ساعته به لولهى حاوي نوترینت براث سترون انتقال داده و سپس کدورت سوسپانسیون میکروبی تهیه شده با استفاده از استاندارد مک فارلند تنظیم شده با دستگاه اسپکتوفتومتر در طول موج 625 نانومتر با میزان جذب 0/13 0/08 (برابر با 10 1/5) 8 CFU/ml به صورت چشمى مقایسه گردید. از محیط کشت نوترینت براث براى آزمایش رقیقسازى در لوله و از محیط کشت مولر هینتون آگار براى روشهاى انتشار در آگار با استفاده از دیسک و رقتسازى در آگار استفاده شد. کلیه محیطهاي کشت بر اساس دستور کارخانه سازنده مرك تهیه و با استفاده از دستگاه اتوکلاو سترون گردید [7] تهیه غلظتهاى عصاره از اتانول 70 درصد براى حل کردن پودر عصاره استفاده گردید. در ابتدا از پودرهاى بهدست آمده از عصارهگیرى غلظت 50 میلىگرم/میلىلیتر تهیه شد. سپس محلول عصاره اتانولى بهدست آمده با غلظت مشخص از فیلترهاى 0/45 میکرومتر عبور دادهشد تا از عدم آلودگى میکروبى عصارهها اطمینان حاصل شود. سترون کردن عصاره براى پوسته و مغز هسته پستهوحشى بهطور جداگانه انجام شد. عصارههاى فیلتر شده در دماى 18 C- در لولههاى آزمایش سترون تا زمان انجام آزمایش نگهدارى شدند [8] بررسی اثرات ضدمیکروبی روش رقتسازى در لوله با استفاده از روش رقتسازى در لوله حداقل غلظت مهارکنندگی رشد (MIC) و حداقل غلظت کشندگی ماده ضدمیکروبی (MBC) تعیین گردید. براي تعیین MIC براي هر عصاره (پوسته و مغز هسته) از یک سري 12 تایی از لولههاي آزمایش استفاده شد. 9 لوله براي آزمایش رقتهاي مختلف هر عصاره و یک لوله بهعنوان کنترل مثبت (حاوى عصاره رقیق شده به علاوه محیط کشت) و یک لوله بهعنوان کنترل منفی (حاوى 1.Minimal Inhibitory Concentration 2. Minimal Bactericidal Concentration 3. Broth Macro dilution susceptibility assay 4. Agar dilution 5. Disk diffusion 6. Staphylococcus aureus 7. Escherichia coli

4 84 فصلنامه علوم و فناوری های نوين غذايی سال اول شماره ٤ تابستان ١٣٩٣ سوسپانسیون میکروبى به علاوه محیط کشت) و همچنین یک لوله حاوى اتانول سوسپانسیون میکروبى و محیط کشت جهت اطمینان از رشد باکترىها در محیط حاوى اتانول بکار رفته براى عصارهگیرى استفاده شد. هر عصاره (غلظت اولیه عصاره 50 میلىگرم/میلىلیتر است که با وارد کردن 1 میلىلیتر از عصاره به لوله اول که حاوى 1 میلىلیتر محیط کشت است غلظت 25 میلىگرم/میلىلیتر بهدست مىآید) با رقتهاي مختلف از لوله شماره یک با غلظت 25 میلىگرم/میلىلیتر تا لوله شماره 9 با غلظت 0/097 میلىگرم/میلىلیتر بهدست آمد به این صورت که براى لوله اول 1 میلىلیتر از عصاره با غلظت 50 میلىگرم/میلىلیتر با 1 میلىلیتر محیط کشت نوترینت براث رقیقسازى شد و به همین ترتیب 1 میلىلیتر از لوله اول برداشته و به لوله دوم که حاوى 1 میلىلیتر محیط کشت نوترینت براث بود انتقال داده و این کار تا لوله شماره 10 انجام گرفت و از لوله آخر 1 میلىلیتر برداشته و بیرون ریخته شد که در نهایت هر لوله نصف رقت لوله قبلى شد. سپس به لولهها به جز لوله شماره 10 (کنترل مثبت) به میزان 50 میکرولیتر سوسپانسیون میکروبی که داراي CFU/ml 10 1/5 8 باکتري بود انتقال دادهشد. رقتسازى عصارهها براى باکترىهاى استافیلوکوکوس اوري وس و اشریشیا کلاى به صورت جداگانه انجام شد. همه لولههاى آزمایش براي مدت 24 ساعت درC 37 قرار دادهشد. پس از طی زمان انکوباسیون لولهها از نظر کدورت ناشی از رشد باکتري تلقیح شده بررسی گردیدند. از همه لولههایی که در آنها عدم رشد باکتري مشاهده شده بود نمونه برداري و جهت تعیین حداقل غلظت کشندگی عصارهها به روش سطحى کشت دادهشد. بدین منظور 100 میکرولیتر از لولههایى که عدم رشد باکترى را نشان مىدادند بر روى محیط کشت مولر هینتون آگار ریخته شد و با پخش کننده بر روى محیط کشت پخش شد. بعد از انکوبه کردن به مدت 24 ساعت پلیتهاي کشت دادهشده از نظر وجود رشد میکروبی کنترل شد. لولهاي که حاوي کمترین غلظت عصاره بود و در پلیت مربوطه عدم رشد باکتري مشاهده گردید بهعنوان MBC آن عصاره در نظر گرفته شد [ 9 و 10 ] روش انتشار در آگار با استفاده از دیسک جهت تهیه دیسکهاي مورد آزمایش هر دیسک با قطر 6/4 میلىمتر از عصارههاي پوسته و مغز هسته تهیه شده با غلظت 50 mg/ml اشباع گردیدند. سپس دیسکها به مدت 1 ساعت روى صفحه مشبک سترون قرار دادهشد تا عصاره بهطور کامل جذب دیسک شود (اگر دیسکها بعد از آغشته سازى مستقیما درون پلیت گذاشته شوند مواد آغشته به دیسک در محیط کشت پخش مىشوند و نتیجه مطلوبى بهدست نمىآید). در هر سري آزمایش یک دیسک حاوي حلال اتانول 70 درصد بهعنوان کنترل منفی بکار برده شد. جهت مقایسهى هالههاى عدم رشد از آنتىبیوتیک وانکومایسین (غلظت 30 میلىگرم در دیسک) و آنتىبیوتیک ریفامپیسین (غلظت 5 میلىگرم در دیسک) بهترتیب جهت جلوگیرى از رشد استافیلوکوکوس اوري وس و اشریشیاکلاى استفاده شد. در این آزمایشها از محیط کشت مولر هینتون آگار استفاده گردید. بعد از ریختن محیط کشت درون پلیت و بسته شدن آن 100 میکرولیتر از سوسپانسیون میکروبى داراى 10 8 cfu/ml روى محیط کشت ریخته و با پخشکننده در تمام نقاط محیط کشت پخش شد. سپس دیسکهاي تهیه شده از عصارهها با غلظتهاى مختلف در فاصله مناسب از یکدیگر کاشته شدند و براي مدت 24 ساعت در گرمخانه 37 درجه سانتیگراد نگهداري شدند. سپس قطر هالههاي عدم رشد با کولیس اندازهگیري و میانگین مربوطه گزارش گردید [ 11 و 12 ] روش رقتسازى در آگار ابتدا غلظتهاى عصاره پس از پخش کردن و بستن محیطها (غلظتهاى نهایى بعد از مخلوط کردن محیط کشت با عصاره محاسبه گردید) در دماى آزمایشگاه و خشک شدن آنها بهطور کامل از سوسپانسیونهاى میکروبى معادل 0/5 مک فارلند آماده شده 10 میکرولیتر برداشته و بر روى محیطهاى کشت که حاوى رقتهاى مختلفى از عصاره هستند به صورت نقطهاى کشت دادهشد. از ترکیب حلال DMSO و محیط کشت بهعنوان کنترل مثبت استفاده گردید. پس از کشت باکترى بر روى این پلیتها آنها در انکوباتور قرار گرفتند و پس از 24 ساعت نتیجه را با

5 85 سيد حميد مرتضوی و همکاران بررسی اثرات ضدميکروبی عصاره اتانولی پوسته و مغز هسته ميوه پسته وحشی بررسى کلنىهاى تشکیل شده در پلیتهاى مختلف حاوى رقتهاى سریالى بررسى کرده و پایینترین رقتى که رشد میکروارگانیسمها را در محیط جامد مهار کرده بهعنوان MIC در نظر گرفته مىشود. در این تکنیک مهار رشد با عدم تشکیل کلنى در روى محیط جامد مشخص مىگردد [13]. 3- نتایج و بحث 1-3- حداقل غلظت بازدارندگى در آزمایشات رقتسازى در لوله حداقل غلظت بازدارندگى عصارهها تعیین شد. روش رقتسازى در لوله براى تعیین خواص ضدمیکروبى روش دقیق و بسیار حساس مىباشد و تاکنون براى تعیین ارزیابى خواص ضدمیکروبى عصارههاى گیاهى استفاده شده است [14]. حداقل غلظت بازدارندگى حداقل غلظتى از عصاره است که مىتواند به میزان 90 درصد از رشد باکترىها جلوگیرى کند. نتایج حاصل از حداقل غلظت بازدارندگى عصارههاى پوسته و هسته پستهوحشى در جدول 1 نشان دادهشده است. حداقل غلظتى از عصارهها که موجب جلوگیرى از رشد 90 درصد از باکترىها شد مربوط به باکترى اشریشیاکلاى و عصاره پوسته است و این غلظت برابر 1/56 میلىگرم در میلىلیتر است (جدول 1 ). مقایسه نتایج MIC شبیه نتایج حاصل از قطر هالههاى مهار رشد باکترىها است بهطورىکه تاثیر عصاره پوسته نسبت به عصاره هسته بیشتر است و همچنین حساسیت باکترى گرم منفى اشریشیاکلاى نسبت به استافیلوکوکوس اوري وس بیشتر است[ 8 ]. میزان MIC عصاره برگ درخت خینجوك براى باکترىها حدود 0/5 0/02 میلىگرم/میلىلیتر و براى قارچها حدود 0/4 0/06 میلىگرم/میلىلیتر است [15]. صمغ ترشحى از درخت خینجوك تاثیر مثبتى در جلوگیرى از رشد باکترىها خصوصا باکترى استافیلوکوکوس اوري وس دارد که حداقل غلظت بازدارندگى آن 125 میلىگرم/میلىلیتر است [16]. گونه خینجوك همانند سایر گونههاى پستهوحشى داراى فعالیتهاى ضدمیکروبى قابل توجهى مىباشد [15] حداقل غلظت کشندگى باکتریایى حداقل غلظت کشندگى باکتریایى حداقل غلظتى از عصاره است که باعث جلوگیرى از رشد 99/9 درصد از رشد باکترىها مىشود. نتایج حاصل از حداقل غلظت کشندگى باکتریایى عصارههاى پوسته و مغز هسته پستهوحشى در جدول 2 نشان دادهشده است. میزان MBC براى باکترى اشریشیاکلاى کمتر از باکترى استافیلوکوکوس اوري وس است که بهدلیل دیواره پپتیدوگلیکان موجود در دیواره استافیلوکوکوس اوري وس است و مقاومت جدول( 1 ) حداقل غلظت بازدارندگى (MIC) عصاره پوسته و هسته پسته وحشى گونه خینجوك میکروارگانیسم عصاره اشریشیاکلاى پوسته هسته 6/25 12/5 1/56* 3/12 استافیلوکوکوس اوري وس * میلى گرم در میلى لیتر جدول( 2 ) حداقل غلظت کشندگی باکتري (MBC) عصاره پوسته و هسته پسته وحشى گونه خینجوك میکروارگانیسم عصاره اشریشیاکلاى پوسته هسته 12/ /3* 6/25 استافیلوکوکوس اوري وس * میلى گرم در میلى لیتر

6 86 فصلنامه علوم و فناوری های نوين غذايی سال اول شماره ٤ تابستان ١٣٩٣ بیشترى از خود نشان مىدهد [8]. پوسته پستهوحشى تاثیر بیشترى روى کشندگى باکتریایى نسبت به هسته از خود نشان داد. بالاترین غلظت MBC مربوط به عصاره هسته پستهوحشى علیه باکترى استافیلوکوکوس اوري وس است و برابر 25 میلىگرم بر میلىلیتر مىباشد. پایینترین غلظت MBC مربوط به عصاره پوسته پستهوحشى علیه باکترى اشریشیاکلاى است و برابر 3/12 میلىگرم بر میلىلیتر مىباشد (جدول 2). خواص بازدارندگى از رشد میکروبها مربوط به ترکیبات فنولى عصارهها است که محلول در حلالهاى قطبى مىباشد. پستهوحشى در گزارش پژوهشهاى اخیر در مورد ترکیبات موجود در عصاره و اسانس این گیاهان داراى ترکیبات فنلى و ترىترپنوي یدها است [ 17 و 18 ]. ترپنها یا ترپنوي یدها ترکیبات فعالى در برابر باکترىها هستند [19]. نتایج حاصل از تجزیه شیمیایى عصاره پستهوحشى گونه خینجوك توسط قاسمى پیربلوطى و همکاران (2011) نشان داد این ترکیبات شامل 15/28 α-pinene درصد 52/33 phellandrene درصد و... مىباشد.این ترکیباتتاثیرات ضدمیکروبىعلیه گونههاىمختلف باکترىها دارند [2]. دو ترکیب α-pinene و terpinolene جزء ترکیبات اصلى با ویژگىهاى ضدمیکروبى بالا هستند [ 3 و 4 ] انتشار در آگار با استفاده از دیسک نتایج مربوط به قطر هالهى عدم رشد در جدول 3 نشان دادهشده است. قطر دیسکهاى مورد استفاده 6/4 میلىمتر بوده است. نتایج حاصل از آزمون انتشار در آگار با استفاده از دیسک نشان داد که پوسته پستهوحشى نسبت به مغز هسته آن اثرات ضد میکروبى بیشترى دارد بهطورىکه بیشترین قطر هاله مهار رشد مربوط به عصاره پوسته براى باکترى اشریشیاکلاى 16 میلىمتر است درحالىکه این مقدار براى مغز هسته 12 میلىمتر بود. همچنین قطر هاله مهار رشد عصاره پوسته براى استافیلوکوکوس اوري وس 13 میلىمتر و براى مغز هسته 9 میلىمتر است (جدول 3). براى هر دو نوع میکروب عصاره پوسته تاثیر بیشترى نسبت به عصاره مغز هسته از خود نشان داده است و این اختلاف معنىدار (0/05 p3) مىباشد. ترکیبات فنلى نقش مهمى در جلوگیرى از رشد باکترىها دارد که تفاوت در تاثیر این ترکیبات به نوع ترکیبات فنولى غلظت ترکیبات فنلى روش عصارهگیرى حلال عصارهگیرى و... بستگى دارد [8]. همچنین تاثیر ترکیبات ضدمیکروبى عصارهها نسبت به باکترى گرم منفى اشریشیاکلاى بیشتر از باکترى گرم مثبت استافیلوکوکوس اوري وس است که احتمال مىرود به دلیل لایهى پپتیدوگلیکان موجود در دیوارهى باکترىهاى گرم مثبت باشد. براى مقایسه تاثیرات ضدمیکروبى عصارهها از آنتىبیوتیک Vancomycin علیه استافیلوکوکوس اوري وس و آنتىبیوتیک Rifampicin علیه اشریشیاکلاى استفاده شد. قطر هالههاى مهار رشد آنتىبیوتیکها از عصارهها بیشتر است (جدول 3). بهروز جدول( 3 ) میانگین قطر هاله عدم رشد عصاره اتانولى پوسته و هسته پسته وحشى عصاره میانگین قطر هاله ى عدم رشد(میلى متر) 13±0/3 d 16±0/15 c پوسته 9±0/2 e 12±0/2 d هسته - - اتانول 70 درصد Vancomycin 18±0/2 b ±0/4 a Rifampicin حروف لاتین غیرمشابه نشان دهنده وجود اختلاف معنى دارى (0/05 p3) مى باشد. خط تیره به معناى عدم تشکیل هاله مهار رشد مى باشد. غلظت عصاره ها 50 mg/ml و غلظت وانکومایسین و ریفامپیسین به ترتیب 30 و 5 میلى گرم در دیسک است.

7 87 سيد حميد مرتضوی و همکاران بررسی اثرات ضدميکروبی عصاره اتانولی پوسته و مغز هسته ميوه پسته وحشی و همکاران (2003) ویژگىهاى ضدمیکروبى صمغ درخت خینجوك را ارزیابى کردند و میزان قطر هاله عدم رشد را براى باکترى استافیلوکوکوس اوري وس 8 میلىلیتر بیان کردند. همچنین قطر هاله عدم رشد عصاره بنه atlantica).p) براى باکترى استافیلوکوکوس اوري وس 16/5 میلىمتر و براى اشرشیاکلاى 9/5 میلىمتر است [20]. عصاره پوسته بنه atlantica).p) داراى قطر هاله 18 میلىمتر علیه باکترى استافیلوکوکوس اوري وس است [21]. عصاره مغز هسته تاثیرات ضدمیکروبى ضعیفترى نسبت به پوسته از خود نشان داد که مىتواند بهدلیل کمتر بودن ترکیبات فنلى هسته نسبت به پوسته باشد. همچنین پوسته بهدلیل نقش حفاظتى خود در مقابل حشرات و مواد خارجى داراى تاثیر بهترى نسبت به هسته مىباشد. روش رقیقسازى در آگار روشى بسیار مناسب و سریع جهت بررسى تاثیرات ضدمیکروبى عصارههاى گیاهان مىباشد و کارایى بهترى نسبت به سایر روشها دارد رقیقسازى در آگار غلظتهاى نهایى بهدست آمده در پلیت در محدوده 0/62-20 میلىگرم در میلىلیتر به صورت دو برابر بهدست آمد. جدول 4 نتایج حاصل از حداقل غلظت بازدارندگى میکروبها در محیط کشت جامد را نشان مىدهد. نتایج بهدست آمده نشان مىدهد که عصاره پوسته خینجوك داراى اثرات ضدمیکروبى بهترى نسبت به مغز هسته مىباشد. بهطورى که در غلظت 2/5 میلىگرم در میلىلیتر عصاره پوسته هیچ کلنى بر روى محیط کشتها براى باکترى اشریشیاکلاى مشاهده نشد.چنینتاثیرىبراى باکترىاستافیلوکوکوساوري وس در غلظت 5 میلىگرم در میلىلیتر مشاهده شد (جدول 4 ). 4 -نتیجه گیرى میوه پستهوحشى علاوهبر گزارش هاى مبنى بر ویژگى آنتىاکسیدانى قوى از خود فعالیت هاى ضدمیکروبى علیه باکترىهاى گرم مثبت و گرم منفى نشان داد. پوسته میوه بهدلیل نقش حفاظتى داراى اثرات ضدمیکروبى بیشترى نسبت به مغز هسته میوه است. در این میان حساسیت باکترى اشریشیاکلاى بیشتر از باکترى استافیلوکوکوس اوري وس بود. پستهوحشى بهعنوان میوهاى ارزان و مفید به لحاظ تغذیهاى و همچنین داراى خواص ضدمیکروبى باید در رژیم غذایى مورد توجه قرار گرفته و مطمي نا پژوهشهاى آتى در این کاربرد موثر خواهد بود. جدول( 4 ) نتایج حداقل غلظت بازدارندگى در محیط جامد حاوى عصاره پوسته و هسته خینجوك باکترى پوسته عصاره هسته 2/5* 5 *میلى گرم در میلى لیتر Pistacia atlantica VAR. mutica. Chemistry of Natural Compounds, 40(1), [3] Raman, A., Weir, U., Bloomfield, Pistacia atlantica VAR. mutica. Chemistry of Natural Compounds, 40(1), [3] Raman, A., Weir, U., Bloomfield, S.F. (1995). Antimicrobial effects of tea tree oil and its major components on Staphylococcus aureus, Staphylococcus منابع [1] Ghasemi Pirbalouti, A., Aghaee, K. (2011). Chemical composition of essential oil of Pistacia khinjuk Stocks grown in Bakhtiari Zagross mountains, Iran. Electronic Journal of Biology, 7, [2] Delazar, A., Reid, R.G., Sarker, S.D. (2004). GC- MS Analysis of the essential oil from the oleoresin of

8 88 فصلنامه علوم و فناوری های نوين غذايی سال اول شماره ٤ تابستان ١٣٩٣ oils of Artemisia afra, Pteronia incana and Rosmarinus officinalis on selected bacteria and yeast strains. Lett Appl Microbiol. 28(4), [13] Gradwohl, R.B.H., Sonnenwirth, A.C., Jarett, L. (1980). Clinical laboratory methods and diagnosis. Mosby Company: St Louis, 267p. [14] Scorzoni, L., Benaducci, T., Almeida, A.M.F., Silva, D.H.S., Bolzani, V.S., Mendes-Giannini, M.J.S. (2007). Comparative study of disk diffusion and microdilution methods for evaluation of antifungal activity of natural compounds against medical yeasts Candida spp and Cryptococcus sp. Journal of Basic and Applied Pharmaceutical Sciences, 28(1), [15] Taran, M., Sharifi, M., Azizi, E., Khanahmadi, M. (2010). Antimicrobial activity of the leaves of Pistacia khinjuk. Journal of Medicinal plants, 9, [16] Bahrouz, M.A., Sirwan, H.Sh. (2003). The antibacterial activity of pistacia khinjuk resionous exudate. Journal of Zankoy Sulaimani, 6, [17]Yalpani, M., Tyman, J.U.P. (1983). The phenolic acids of Pistachia vera. Phytochemistry, 22, [18] Marner, F.J., Freyer, A., Lex, J. (1991). Triterpenoids from gum mastic: The resin of Pistacia lentiscus. Phytochemistry, 30, [19]Cowan, M.M. (1999). Plants Products as Antimicrobial Agents. Clinical microbiology reviews, 4, [20] Benhammou, N., Atik Bekkara, F., Kadifkova Panovska, T. (2008). Antioxidant and antimicrobial activities of the Pistacia lentiscus and Pistacia atlantica extracts. African Journal of Pharmacy and Pharmacology. 2, [21] Malekzadeh, F. (1974). An antimicrobial compound in two Pistacia species. Mycopathologia et Mycologia applicata, 54, epidermidis and Propionibacterium acnes. Appl. Microbial, 21, [4]Carson, C.F., Riley, T.V. (1995). Antimicrobial activity of the major components of the essential oil of Melaleca alternifoli. Journal Appl. Bacteriol, 78, [5] آزادمرد دمیرچى ص. (1389). شیمى و تجزیه روغنها و چربىهاى خوراکى. انتشارات عمیدى تبریز. [6] حاجى مهدىپور ه. خانوى م. شکرچى م. عابدى ز. پیرعلى همدانى م. (1388). بررسى بهترین روش استخراج ترکیبات فنلى موجود در گیاه سرخارگل. فصلنامه گیاهان دارویى سال هشتم دوره 4 جلد [7] جلالی م. عابدي د. قاسمی دهکردي ن. چهارمحالى ا. (1385). بررسی اثرات ضدمیکروبی عصاره هیدروالکلی تعدادي از گیاهان دارویی علیه باکترى لیستریا مونوسیتوژنز. دانشگاه علوم پزشکى شهرکرد دوره 8 شماره [8] Das, K., Tiwari, R. K. S., Shrivastava, D. K., (2010). Techniques for evaluation of medicinal plant products as antimicrobial agent: Current methods and future trends. Journal of Medicinal Plants Research, 4(2), [9] Vanden, D.A., Vlietinck, A.J., In Dey, P.M., Harborne, J.B. (1991). Methods in plant biochemistry: screening methods for antibacterial and antiviral agents from higher plants. London: Academic Press, [10] Sindambiwe, J.B., Calomme, M., Cos, P., Totte, J., Pieters, L., Vlietinck, A. (1999). Screening of seven selected Rwandan medicinal plants for antimicrobial and antiviral activites. Journal Ethnopharmacol. 65(1), [11] Baner, A.W., Kirby, W.M.M., Sherries, J.C., Truck, M. (1991). Antibiotic susceptibility testing by a standardized single disc method. Am J Clin Pathol, 45, [12] Mangena, T., Muyima, N.Y. (1999). Comparative evaluation of the antimicrobial activities of essential